6-FAM-phosphoramidit

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Strukturformel
Struktur von 6-FAM-phosphoramidit
Allgemeines
Name 6-FAM-phosphoramidit
Andere Namen
  • 6-FAM-amidit
  • [(3',6'-Dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit
  • 2,2-Dimethylpropansäure-1,1′-(6-{10-[bis(1-methylethyl)amino]-13-cyano-1-oxo-9,11-dioxa-2-aza-10-phosphatridec-1-yl}-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9′-(9H)xanthen]-3′,6′-diyl)ester (IUPAC)
Summenformel C46H58N3O10P
Kurzbeschreibung

schwach gelbes Pulver[1]

Externe Identifikatoren/Datenbanken
CAS-Nummer 204697-37-0
PubChem 16211911
ChemSpider 17339829
Wikidata Q245488
Eigenschaften
Molare Masse 843,94 g·mol−1
Aggregatzustand

fest[1]

Sicherheitshinweise
GHS-Gefahrstoffkennzeichnung [1]
keine GHS-Piktogramme

H- und P-Sätze H: keine H-Sätze
P: keine P-Sätze[1]
Soweit möglich und gebräuchlich, werden SI-Einheiten verwendet.
Wenn nicht anders vermerkt, gelten die angegebenen Daten bei Standardbedingungen (0 °C, 1000 hPa).

6-FAM-phosphoramidit, auch 6-FAM-amidit, ist das Phosphoramidit-Derivat des 6-Carboxyfluorescein (FAM), ein Fluoreszenzfarbstoff, der bei in der Synthese von Oligonukleotiden zur Erzeugung von Hydrolisierungssonden für Real-Time-PCR-Assays und somit zum quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen verwendet wird.

Zunächst wird der Vorläufer für die Phosphoramidit-Einheit synthetisiert. Dazu wird Phosphortrichlorid erst mit 3-Hydroxypropionitril und dann mit Diisopropylamin umgesetzt. Die Fluorescein-Einheit wird ausgehend von Resorcin und Trimellitsäureanhydrid hergestellt. Die Estergruppen werden mittels Pivaloylchlorid eingeführt. Die Verbindung wird zunächst in situ mittels 4-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid in einen Nitrophenylether überführt. Dieser reagiert mit 6-Aminohexanol, wodurch die C6-Kette als Brücke eingeführt wird. Reaktion mit dem separat synthetisierten Phosphorreagenz ergibt das 6-FAM-Phosphoramidit.[2]

6-FAM-phosphoramidit ist ein Reporter-Farbstoff, der kovalent an das 5’-Ende der Sonde gebunden ist, die für das Farbsignal der Reaktion verantwortlich ist. Die Anregungswellenlänge von 6-FAM-phosphoramidit liegt bei 496 nm, die Emissionswellenlänge bei 520 nm. Am 3’-Ende der Sonde ist ein Quencher-Farbstoff gebunden (z. B. TAMRA). Die mit einer 5’-Exonukleaseaktivität ausgestattete Taq-Polymerase löst den Reporterfarbstoff von der DNA ab. Nach der vollständigen Synthese des PCR-Produkts wird auch der Quencherfarbstoff frei. Durch die räumliche Trennung gibt der Reporterfarbstoff nach Anregung ein Fluoreszenzsignal. Wird hingegen die intakte Sonde angeregt, so unterdrückt der Quencherfarbstoff aufgrund der räumlichen Nähe zum Reporterfarbstoff dessen Fluoreszenz.[3] [4]

Einzelnachweise

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  1. ↑ a b c d Datenblatt 6-FAM-phosphoramidit bei Sigma-Aldrich, abgerufen am 22. Mai 2017 (PDF).Vorlage:Sigma-Aldrich/Name nicht angegeben
  2. ↑ Alexander Stepakov, Svetlana Galkina, Denis Bogomaz, Elena Gaginskaya, Alsu Saifitdinova: Modified Synthesis of 6-carboxyfluorescein (6-FAM): Application to Probe Labeling for Conventional Cytogenetics. In: British Journal of Applied Science & Technology. Band 7, Nr. 4, 10. Januar 2015, S. 423–428, doi:10.9734/bjast/2015/15991 . 
  3. ↑ Thomas A. Schild, Einführung in die Real-Time TaqManTM PCR-Technologie, 28. Mai 1998, abgerufen am 1. Oktober 2024
  4. ↑ Datenblatt 6-FAM-phosphoramidit bei Sigma-Aldrich, abgerufen am 1. Oktober 2024 (PDF).Vorlage:Sigma-Aldrich/Name nicht angegeben
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