バイオテクノロジー

NBRCニュース 第88号

NBRCニュース 第88号
2024年08月01日
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1.
新たにご利用可能となった微生物株
だいやまーくNBRC株
酵母4株、糸状菌15株、細菌19株、藻類2株が新たにご利用可能となりました。

糸状菌では、国内の土壌から分離され、高活性・高安定性のβ-グルコシダーゼ産生能を有するTalaromyces pinophilus NBRC 116607や、固体培地での培養でクエン酸を高生産するAspergillus lacticoffeatus NBRC 115414を公開しました。また、海生担子菌として知られるNia属の2024年に記載された新種を含む9株(NBRC 116470〜116477、NBRC 116485)を公開しました。

細菌では、次世代プロバイオティクスとして期待されているFaecalibacterium属の新種(NBRC 116372, NBRC 116373)の分譲を開始しました。

【新たに分譲を開始した微生物資源】
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/new_strain/new_dna.html
2.
微生物の観察法(3)
走査電子顕微鏡による微生物観察のための試料作製法(糸状菌編)
(山口 薫)
NBRCニュースNo.79「光学顕微鏡による糸状菌の観察」では、糸状菌の形態観察、特に胞子の形成様式の観察の重要性と、胞子の構造を壊さないプレパラート作製のテクニックをご紹介しました。本稿では、さらに立体的な構造を観察できる走査電子顕微鏡(SEM; Scanning Electron Microscope)による観察のための試料作製法を解説します。
SEMには2種類あり、低真空SEMは観察試料の前処理をしなくても観察することができますが、高真空SEMの方がより高い解像度の画像を得ることができます。高真空SEMでは、固定、脱水、乾燥、金属コーティングという手順からなる試料の前処理が必要となり、特に糸状菌の形態観察では寒天培地や、材や葉などの天然基質の上をはった菌糸やそこから立ち上がって形成された胞子の構造をくずさないように処理を行う工夫が求められます。今回は寒天培地に培養した糸状菌から観察試料を作製する時の前処理方法をご紹介します。

だいやまーく培養
観察したい構造を作るのに必要な培養日数を考慮して微生物の培養を開始します。PCA(Potato Carrot Agar)培地などの貧栄養の培地で培養すると、菌糸が密にならないため構造を観察しやすくなります。糸状菌は寒天培地に接種したところから菌糸を伸ばして成長するため、コロニー中心部に形成された胞子は成熟しているのに対し、コロニー外縁部の胞子は若く未熟なものになります。胞子形成の初期段階から成熟した構造までを試料として切り出すことで、胞子形成様式を観察することができます。
だいやまーく試料の切り出し
観察したい試料は、寒天培地からメスなどで大きめに切り出してシャーレに移し、実体顕微鏡下でよい場所を確認しながらSEMの試料台より少し小さめのサイズになるようにトリミングします。NBRCでは直径10mmの試料台(直径10mm×高さ10mm、アルミニウム製)を使用しているため、試料は5mm角くらいのサイズになります。次に、秤量瓶の中に一回り小さいバスケットを入れ、その中にトリミングした試料を入れます。次の固定・乾燥のステップで行う溶液の入れ替え作業を秤量瓶とバスケットの間で行うことで水流を和らげ、糸状菌が寒天上に作った構造が崩れるのを防ぎます。NBRCでは、直径約30mmの秤量瓶には、直径約20mmのガラス管を15mm程度の長さに切り、片方にメッシュ生地を張ってナイロンテグスでとめた手作りバスケットを使用しています(図1 A)(1)。
記事2画像1_メルマガ88号
だいやまーく固定
秤量瓶とバスケットの隙間からパスツールピペットなどでやさしく固定液(NBRCでは糸状菌の固定に1%オスミウム酸水溶液を使用しています。これは、四酸化オスミウムを蒸留水に溶かして濃度1%にしたもので、市販の2〜4%濃度のものを1%に希釈することでも同様に使用できます)を入れ、室温で2時間、または4°Cで一晩おいて固定します。構造がくずれやすい試料は液に浸さずにバスケットの周囲に固定液を数滴たらし、同様に室温で2時間、または4°Cで一晩おいて蒸気固定を行います。
なお、オスミウム酸は強力な酸化剤で毒性と揮発性が高いことから、必ず手袋を着用し、ドラフトチャンバー内で取り扱います。固定液は冷蔵庫で保管できますが、必ず2重容器に入れ、容器のフタはプラスチックパラフィンフィルム等でシールして下さい。これを怠ると揮発したオスミウム蒸気が漏れ出し冷蔵庫が黒くなってしまいます。

だいやまーく脱水
エタノールで脱水します(図1 B)。パスツールピペットなどで固定液を秤量瓶とバスケットの隙間から吸い出して棄て、30%エタノール水溶液を試料が完全に浸かるように入れて15〜20分おき、30%エタノール水溶液を棄て、今度は50%エタノール水溶液を入れて15〜20分おき・・・を繰り返し、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%のエタノールまで段階的に濃度を上げていき、試料中の水分をエタノールに置換することによって脱水します。エタノール濃度が高くなると蒸発しやすいので、後半の液の入れ替え作業は丁寧に、かつ、すばやく行います。
次に、二酸化炭素(液化炭酸ガス)を用いて臨界点乾燥装置にかけるための前処理としてエタノールを酢酸イソアミルに置換します。エタノール:酢酸イソアミルの混合液を30分ごとに2:1、1:1、1:2の割合のものに入れ替えた後、酢酸イソアミル100%に置き換えます。酢酸イソアミル100%に置き換えた時は1時間おき、それを2〜3回繰り返します。
なお、次のステップである乾燥を臨界点乾燥装置の代わりに凍結乾燥装置で行う場合は、酢酸イソアミルの部分をt-ブタノールにします。

だいやまーく乾燥
臨界点乾燥装置用のバスケット(直径15mm×高さ8mm)に濾紙を敷いて試料をピンセットで移し入れ、臨界点乾燥装置にかけます(図2)。試料中の酢酸イソアミルは装置の中で二酸化炭素に置換され、その後、温度を上昇させることで圧力も上昇させ、試料を二酸化炭素の臨界点以上(二酸化炭素の場合、臨界温度は31.1°C以上、臨界圧力は7.38MPa以上)の状態にします。この臨界状態では、物質は気体と液体の区別がなくなり、表面張力が働かなくなります。この状態を維持しながら、徐々にガスを排出することで、試料をひしゃげさせることなく乾燥することができます。ひしゃげてしまうと菌糸がぺったんこにつぶれたり、細胞の表面がしわしわになったりします。プログラムは装置ごとに異なりますが、糸状菌は乾燥時に構造がひしゃげやすいので、臨界点後のガスの排出はゆっくり行います(2)。
なお、臨界点乾燥装置の設置には高圧ガス保安法に則した都道府県への届け出が必要です。
記事2画像2_メルマガ88号
だいやまーく金属コーティング
乾燥した試料をバスケットから取り出し、導電性のカーボンテープを貼った試料台に実体顕微鏡下で試料の裏表に気をつけながら貼り付けます。SEM観察時に電子がたまらないように導電性を良くするため、試料は構造をくずさない程度にできるだけカーボンテープに接するように貼り付けて、浮かないようにしてください。その後、スパッタ装置にかけて金属コーティングを行います。NBRCの微生物画像の提供で公開しているSEM画像は白金パラジウムで膜厚約100Åでコーティングをしています(図3)。コーティングに使用される金属には金や四酸化オスミウムなどもあり、粒子が小さい金属でコーティングする方が表面の構造がより詳細に表現されます。

以上で、試料の前処理は完了です。あとは、目的にそった構造をひたすら探す根気をもってSEM観察に臨んで下さい。
記事2画像3_メルマガ88号
【文献】
(1) 中桐 (1999) 日本菌学会報 40, 61-64.
(2) 日本電子顕微鏡学会関東支部編 (2000) 走査電子顕微鏡 共立出版株式会社
3.
DBRP掲載株のご紹介(9)
東海国立大学機構 岐阜大学 微生物遺伝資源保存センター(GCMR)
について
(岐阜大学 微生物遺伝資源保存センター 林 将大 田中 香お里)
1. GCMRの成り立ち
GCMR(以下、当センター)では感染症法における特定病原体等を含む高度病原細菌から日和見細菌までのヒトに関する病原細菌を中心とした幅広いコレクションを有しています。上記菌群における基準株および血清型のパイロット株、細菌の同定機器における参考株および野生株の保有数については、網羅的なライブラリーであり、他の国立大学では類を見ません。この網羅的なコレクションは、これまでに岐阜大学医学部微生物学教室およびその流れをくむ病原体制御学分野を教授として主宰してきた3名の世界的に著名な細菌分類学者の研究に伴って半世紀以上の時間をかけて形成されたものです。詳細は割愛しますが、細菌の分類学研究には系統だった関連する周辺の属、菌種の菌株が必要であるため、それぞれの教授の主要な研究対象に関連する幅広い菌種が系統的に収集されてきました。

2. 保有菌株の特性
当センターでは、上述したように前身施設から引き継いだ菌株を維持管理しながら分譲業務を行っています。当センターが保有している病原細菌コレクションの特徴としては、高度病原体から日和見病原体まで網羅的に保有していることです。これらの中には半世紀以上前に分離・保存された株も多く含まれており、現在では安全保障上、海外のリソース機関からの入手が困難な菌種も少なくありません。これらの保存株について、分譲業務の傍ら、引き継いだ古いコレクションのリストとの照合、保存バイアルからの培養法に基づく生死確認、コンタミネーション株からの分離作業および菌種の再同定作業を順次進めています。また、保存時から歴史的に菌種名が変更されている菌群も存在するため、日々、リストの更新作業も進めています。2024年現在、現状の保管リストには、BSL2およびBSL3の特定病原体1,500株を含む約350属・約19,000株が登録されています。また、感染症法上の二類〜五類感染症に指定されている病原体を含む約80属、約47,000株を公開しています。特に、腸管感染症由来、呼吸器感染症由来の野生株が豊富に保存されています。

近年の分譲依頼では、分離源が明確でかつ分離年度が比較的新しい株を求められることが増えてきました。こういった希望に対し、我々は近隣の医療機関および検査機関との協力のもと、野生株(臨床分離株を含む)を定期的に入手しています。問い合わせが多い菌群、広報活動時のアンケートおよび分譲希望者からの要望にしたがって計画的に年間数百株を収集しています。繰り返しになりますが、分離年度が新しい菌株が入手可能であるということも当センターの特徴のひとつであると考えています。

今日、病原細菌が分離される機関は、主として医療機関あるいは検査機関に限られますが、これらの機関は分離された株の継続的な維持を目的としていません。一般的に診断・治療を目的とした病原細菌の分離であるため、日々、患者の検体から多数の病原細菌が分離されていますが、診断・治療後には役目を終えた菌株の大多数が廃棄されています。しかしながら、研究・開発、あるいは教育の現場で病原細菌を使用する場合、自ら必要な病原細菌を収集するのは容易ではありません。菌株を研究者個人で収集するのは難しく、国内の主要リソースにおいては、病原細菌の菌種数および株数は限られています。国外に目を向けた場合、入手先として海外のリソース機関も選択肢に入ってきますが、病原体であるが故に輸入に必要な手続きが煩雑でかつ、幅広い野生株の入手は困難です。当センターは、役目を終えた菌株にわが国の病原細菌リソースとして新たな役割を吹き込むことも重要な業務だと認識しています。

現在ではさらに利用者の垣根を低くすることを目的として、P3、P2レベルの実験室がない利用者に向けてDNAの分譲を積極的に実施しています。さらに、病原細菌の使用経験が少ない利用者に向けた菌株の共同利用等も成果を上げています。当センターが整備し、提供する菌株は、細菌感染症の研究や教育だけでなく感染症診断法の研究・開発など基礎研究から応用研究、検査の標準菌株として、製品の開発まで多様な用途に利用されています。利用者の内訳は、大学をはじめとする教育機関、各研究機関、医療機関、検査機関の他、医療やライフサイエンスに関わる事業を展開する様々な企業に分譲実績があり、利用者の半数は企業です。

3. おわりに
社会情勢、関心の変化に伴い、今後も領域横断的な多様な研究の展開が予想されます。より多様なニーズに対応すべく、研究の動向を注視し、必要とされる系統を整備し維持していくこと、また、高度病原体については、コンプライアンスを遵守し安全な資源提供をしていくことが肝要と考えています。少しでも多くのライフサイエンス研究者に当センターの存在を認知していただけるよう広報活動にも注力しつつ、安全性を担保しながらより利用しやすいリソースとなるよう整備を進めていきたいと考えています。
GCMRへのアクセスは下記DBRPのコレクション情報から可能です。ご興味のある方は、ぜひ当センターのリソースをご活用ください。

【微生物遺伝資源保存センター(GCMR)の菌株コレクション】
https://www.nite.go.jp/nbrc/dbrp/dataview?dataId=COLL0001100000001
4.
令和6年能登半島地震で被災した生物遺伝資源の無償提供のお知らせ
(再掲)
令和6年能登半島地震で被災された皆様に、心よりお見舞い申し上げます。

前号でお知らせした通り、NBRCは、能登半島地震被災地の復興を支援するため、被災地域の企業・大学等を対象に、地震により滅失した生物遺伝資源(NBRC株、DNAリソース及びRD株)の再提供を無償で行っております。これらの生物遺伝資源の再提供をご希望される方は、以下のウェブサイトをご確認の上、NBRCまでお申し込みください。

NBRC職員一同、被災地の一刻も早い復興をお祈りいたしております。

【令和6年能登半島地震で被災した生物遺伝資源の無償提供】
https://www.nite.go.jp/nbrc/information/shien2024.html
5.
DBRP(生物資源データプラットフォーム) 〜更新情報のお知らせ〜
しかくGIフォーラム会員専用データを公開(2024年6月26日)
NBRCメールマガジン第87号でご案内したグリーンイノベーションフォーラム(GIフォーラム)について、参加会員の方に限定したデータの提供を開始しました。GIフォーラム会員専用データは、NITEコンソーシアムが取得したCO2を原料とした有用物質生産に寄与する微生物とその関連情報です。GIフォーラムに参画しGIフォーラムデータ利用申請書をご提出いただければ、本データをDBRP上で閲覧することができます。

GIフォーラムの概要や入会手続きについては、以下URLをご参照ください。

【グリーンイノベーションフォーラム(GIフォーラム)について】
https://www.nite.go.jp/nbrc/GIforum_top.html

DBRPに登録したGIフォーラムのプロジェクト情報は、以下URLをご参照ください。

【グリーンイノベーションフォーラム(GIフォーラム)プロジェクト情報】
https://www.nite.go.jp/nbrc/dbrp/dataview?dataId=PROJ0000700000001
6.
2024年度NITE講座(認定センター)参加者募集のお知らせ
毎年度恒例のNITE講座が、今年度も開催されます。第1弾は、適合性認定分野(認定センター)が行います。この講座では、「試験」「検査」「認定」をはじめとした「適合性評価」の概要、「認定」の基礎的な内容や、認定と関係する国際規格について解説します。

日時: 2024年9月5日(木) 午後1時15分〜午後3時15分
受講方法: オンライン(WEBEXウェビナー)

参加申込は以下のリンクから可能です。ぜひご参加ください。

【NITE講座(2024年度)受講生募集のお知らせ】
https://www.nite.go.jp/iajapan/information/iajapan-kouza_2024.html
7.
NBRCが展示、発表等を行うイベントについて
以下のイベントにて出展、講演、発表等を行います。ぜひご参加ください。

第97回日本細菌学会総会
日時:2024年8月7日(水)〜9日(金)
会場:札幌コンベンションセンター(北海道札幌市白石区東札幌6条1-1-1)
URL:https://aeplan.jp/jsb2024/
NITEの参加形態:ブース出展

日本技術士会生物工学部会 2024年8月例会(夏の例会)
日時:2024年8月24日(土)14:00〜17:00
参加対象:日本技術士会 正会員・準会員(部門・地域不問)
会場:機械振興会館 会議室(東京都港区芝公園3-5-8)/オンライン(Teams)
URL:https://www.engineer.or.jp/c_dpt/bio/topics/010/010272.html
NITEの参加形態:講演

第3回 おおさかグリーンTECH
日時:2024年9月6日(金)13:30〜17:00
会場:大阪産業創造館 4階 イベントホール(大阪府大阪市中央区本町1-4-5)
URL:https://orist.jp/morinomiya/events/seminar/2024/09/20240906_greentech.html
NITEの参加形態:講演

日本防菌防黴学会 第51回年次大会
日時:2024年9月17日(火)、18日(水)
会場:タワーホール船堀 (東京都江戸川区船堀4-1-1)
URL:https://www.saaaj.jp/conference/
NITEの参加形態:ブース出展、ポスター発表

BioJapan 2024
日時:2024年10月9日(水)〜11日(金)
会場:パシフィコ横浜 (神奈川県横浜市西区みなとみらい1-1-1)
URL:https://jcd-expo.jp/ja/
NITEの参加形態:ブース出展、セミナー主催

編集後記
顕微鏡で見る微生物の姿は肉眼で見えるものとは全くといっていい程違っていますね。普段の身のまわりの風景も、見えていないもの、気付いていないことなどがまだまだたくさんあるのだろうと思わせてくれます。大きく視点を変えることを気に留めて周囲を見直してみたいと思います。(BS)
微生物情報の検索は「DBRP(生物資源データプラットフォーム)」
NBRC株の検索、ご依頼は「NBRCオンラインカタログ」
微生物に関するご相談は「微生物コンシェルジュ」
微生物の有害情報の検索は「M-RINDA」
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・NBRCニュースは偶数月の1日(休日の場合はその前後)に配信します。次号(第89号)は2024年10月1日に配信予定です。

編集・発行
独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジーセンター(NBRC)
NBRCニュース編集局(nbrcnews【@】nite.go.jp)
(メールを送信される際は@前後の【】を取ってご利用ください)

お問い合わせ

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(お問い合わせはできる限りお問い合わせフォームにてお願いします)
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関連サイト
微生物資源の保全と持続可能な利用のためのアジア・コンソーシアムへのリンク。別ウィンドウで英語サイトを開きます。ACM The Asian Consortium for the Conservation and Sustainable Use of Microbial Resources. Open English site in new window.
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